Допинг: поиск запрещенных препаратов

Какие соединения являются допингом, какова технология выявления запрещенных веществ у атлетов и для чего нужны биологические паспорта

 

Допинг — это самые разнообразные методы воздействия на организм, которые потенциально могут улучшить спортивный результат, что делает их применение атлетами неэтичным и противоречит самой концепции спорта.

В допинг входят в основном лекарственные препараты, разработанные для лечения различных заболеваний и применяемые в различных лечебных целях. Периодически лист допинг-препаратов меняется, и появляются дополнения. Так, мы знаем, что в 2016 году в него попал мельдоний — препарат метаболический. Некоторые соединения включены в этот лист целыми группами — к применению запрещены все стероиды. В этом листе есть отдельный раздел, говорящий о том, что запрещены все так называемые дизайнерские лекарства и препараты, находящиеся на стадии клинических исследований. То есть, даже если нам не понятно, будет ли новорожденное лекарство улучшать результаты спортсменов, оно по умолчанию запрещено. В допинг-лист также попали и благородные газы — аргон и ксенон, которые сейчас очень активно применяются в медицине и вызывают ряд удивительных физиологических эффектов.

Для выявления факта использования многих препаратов, включенных в список ограничений, проводятся стандартные и довольно простые тесты, основанные на иммунно-ферментном анализе и других рутинных биохимических методах, и по тому же принципу, что и тестирование крови в биохимических лабораториях.

Но поиск некоторых видов допинга в крови и моче является очень сложной технологической процедурой. Нам может казаться, что анализ на допинг прост, потому что мы все ходим в лаборатории для сдачи анализов крови и мочи. При этом технологически тщательный анализ на допинг представляет собой кардинально более сложный процесс. В основном, для того чтобы выяснить, принимал спортсмен допинг или нет, используется анализ мочи, но сейчас к нему подключился и анализ крови. Чаще всего тестирование на допинг происходит во время спортивных соревнований, но есть вероятность того, что между соревнованиями офицер Всемирного антидопингового агентства (WADA) приедет и заберет пробу у спортсмена, чтобы выяснить, не принимал ли он допинг в период подготовки. Это связано с тем, что все лекарственные препараты вымываются из организма, поэтому чем ближе к моменту приема препарата проведен анализ, тем более он чувствителен.

Методы выявления допинга

К запрещенным веществам относятся все стероиды и многие «сложные» органические молекулы, для выявления которых используется очень продвинутая технология высокоэффективной жидкостной хроматографии в тандеме с масс-спектрометрией.

Разнообразные вещества, находящиеся в крови, можно «разогнать», то есть выделить их спектр на колонке для проведения жидкостной хроматографии. После этого мы видим спектр различных соединений и знаем, в какой полоске спектра находятся те или иные соединения, причем похожие по химическим свойствам молекулы могут сливаться в одну полоску. И чтобы узнать, что за соединения входят в каждую полоску этого спектра, нам нужно «взвесить» их микроколичество и определить их точный качественный состав. Это делается при помощи метода масс-спектрометрии.

Для более точного определения соединений, входящих в спектр, отдельный фрагментик спектра, полученного с использованием жидкостной хроматографии, переносится в масс-спектрометр (в форме ионов). На масс-спектрометре мы видим пики соединений, имеющие различную молекулярную массу, и чем больше соединения в моче, тем выше пик. Очень упрощая, можно сказать, что исследователь, проводящий высокоэффективную жидкостную хроматографию в тандеме с масс-спектрометрией, наблюдает большую «горную гряду» различных пиков и, пока он не заинтересовался конкретным пиком, не понимает, что за соединение за ним прячется.

На данный момент не существует методологии, которая бы позволила с высокой долей достоверности проанализировать в автоматическом режиме и без значительных трудозатрат оператора, сколько каких соединений находится в моче. Количество различных липидов, к которым относятся стероиды, крайне сложно установить, несмотря на бурное развитие биохимических технологий. Метод ЯМР-спектроскопии способен значительно быстрее выявить и отсортировать молекулы, чем масс-спектрометрия, но у него есть ряд ограничений: стоимость метода, доступность установки и сложность обслуживания. Этот метод подходит только для идентификации молекул с небольшой молекулярной массой, коими является большинство запрещенных лекарственных препаратов и стероидов.

Существует список, включающий несколько десятков стероидов, молекулярная масса и свойства ионов которых нам хорошо известны, и мы знаем, какому пику соответствует тот или иной стероид или его метаболит. Если спортсмен не употреблял, к примеру, стероид метандиенон, то в том месте, где он мог появиться на горной гряде, будет провал. Если же он его принимал, то в этом месте будет маленький пик, и чем дольше он его принимал, тем выше пик.

Естественные стероиды, содержащиеся в организме человека, также образуют пики, но если человек употребляет избыточное количество какого-то естественного стероида, то этот пик будет невероятно высоким. Это касается тех стероидов, которые мы знаем. Но настоящая сложность с тестами заключается в том, что спортсмены могут принимать «дизайнерские» (сделанные под заказ) стероиды с самыми различными молекулярными массами, которые могут прятаться за более высокими пиками естественных стероидов или других соединений, присутствующих в нашей моче или крови. Чтобы вычислить это, нужно догадаться выделить и проанализировать определенный пик горной гряды, к которому ранее не присматривались. И следует отметить, что метод, способный в определенной мере упростить эту процедуру и поставить на поток выявление запрещенных веществ, был разработан только в 2005 году.

Биологические паспорта

Для того чтобы сделать спорт честным, придумали биологические паспорта. Раньше они были введены для того, чтобы прекратить манипуляции с кровью — введение себе той крови, которая была заготовлена перед соревнованием, или введение гормона эритропоэтина, увеличивающего количество эритроцитов и повышающего выносливость атлета. Даже если вы не можете найти в моче сам эритропоэтин, вы видите кардинальное увеличение красных кровяных телец.

Несколько лет назад были введены и «стероидные паспорта», то есть теперь в моче атлетов фиксируется общее количество стероидов. Это значит, что уже не столь важно, какие пики есть на масс-спектрометре и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Если количество стероидов в тесте спортсмена серьезно превысит то, которое было зафиксировано ранее, то будет установлен факт употребления стероидов, даже если конкретный стероид не был определен.

Процесс метаболизма различных соединений в организме крайне сложен, поэтому, даже если спортсмен принимает молекулу синтетического стероидного гормона, о котором мы знаем все, она может модифицироваться в его организме в совершенно другое соединение. На сегодняшний день у нас нет моделей, которые могли бы достоверно предсказывать, что конкретно наша печень сделает из той или иной молекулы. Некоторые исследователи, для того чтобы точнее предсказывать спектр метаболитов, предлагают использовать особых мышей, которым была вживлена человеческая печень. Метод состоит в том, чтобы давать мышам запрещенные WADA соединения и анализировать в их моче метаболиты, которые будет давать гуманизированная печень. Полученная информация позволит по-новому взглянуть на спектры хроматографии в тандеме с масс-спектрометрией и обратить внимание на те области, которые ранее не представляли интереса.

Лаборатория Шерлока Холмса

Таким образом, поиск запрещенных препаратов представляет собой очень сложную технологическую процедуру, поэтому в мире только 34 лаборатории, аккредитованные WADA, которые могут проводить такие тесты. Чем серьезнее состязания, тем более серьезные методы идентификации соединений в них используются. В не самых крупных чемпионатах поиск допинга проводится по списку с помощью не самого чувствительного метода (без масс-спектрометрии), позволяющего в ряде случаев спрятать стероиды. Если на обычном соревновании можно утаить факт применения допинга, то на крупных спортивных соревнованиях это становится практически невозможно.

Нужно понимать, что скрупулезное липидологическое и масс-спектрометрическое тестирование проводится лишь в особых случаях, оно никогда не было широкомасштабным. А при рутинной масс-спектрометрии, даже проводящейся в аккредитованной WADA лаборатории, проводится определение фиксированного перечня запрещенных молекул и их метаболитов, то есть проводится поиск того, что уже хорошо известно, как искать. Продвинутый специалист по масс-спектрометрии подобен Шерлоку Холмсу — это единичные люди со сверхвысокой квалификацией, подключающиеся к тестированию только в случаях высокой вероятности применения спортсменом запрещенных (в том числе дизайнерских) препаратов, которые не удалось найти обычным путем.

Представляется, что если провести массовый углубленный анализ мочи и плазмы крови атлетов из разных стран, которые победили на соревнованиях, с использованием масс-спектрометрии последнего поколения и МР-спектроскопии, то, весьма вероятно, там могут обнаружиться очень интересные субстанции, присутствующие только в моче и крови элитных атлетов.