FINES Project: что будет сделано. Часть 2.

 Have a dream? Run to it. Cannot run? Walk to it. Cannot walk? Crawl to it. Cannot crawl? Lay in the dream direction!

Do you have a dream?..

Слова народные в интерпретации balsara

Рождение идеи.
Оформление идеи.
Копнуть вглубь.
Зачем это надо.
Что планируется сделать в базовом эксперименте.
Финансы
    

   FINES Project распланирован нами на 4 части: базовый эксперимент и три дополнительных.
   О базовом эксперименте мы уже много рассказывали, осталось поговорить о дополнительных экспериментах. Заодно пройдусь по некоторым фармакологическим вещам, которые для себя открыл.
   Дополнительный эксперимент 1.
   Если вы помните, то в отношении экспериментальных веществ у нас есть следующая гипотеза. Вне зависимости от того, куда "воткнули" в их молекулу фенильную группу, она всё равно будет делать молекулу неполярной и способствовать её проникновению через гемато-энцефалический барьер в мозг. Сперва мы хотели включить в свой проект классическую проверку этого предположения с помощью фармакокинетических опытов in vivo. В ходе таких опытов крысам вводят экспериментальные вещества, потом отбирают кровь и ткань мозга, анализируют биологические образцы и строят так называемые фармакокинетические кривые, которые сравнивают по различным параметрам и оценивают поведение того или иного вещества в организме. Но по нескольким причинам пришлось отказаться от включения таких экспериментов даже в отдалённую перспективу. Сначала я расстроился, а потом успокоился.
   Во-первых, такой эксперимент баснословно дорог: 15 000 $ за одно вещество в стандартном эксперименте. Но наш эксперимент нестандартный, так как надо анализировать ткань мозга. И веществ целых три.
   Во-вторых, пожалел крыс. Честно. Не нормобарическая гипоксия с гиперкапиней, конечно, но всё равно.
   В-третьих, как оказывается, не всегда информативно. Поясню. Во время классических фармакокинетических исследований определяют общую концентрацию лекарственного средства в биологической жидкости. Но на самом деле очень многие лекарственные средства связаны в организме человека с белковыми молекулами и в таком виде активности не проявляют. Поэтому если лекарство обнаружено в том или ином биологическом материале, то это совсем не означает, что все его молекулы производят там своё биологическое действие. Посему нами была найдена весьма достойная и адекватная замена опытам in vivo - опыты по моделированию проницаемости in vitro.
   ГЭБ, или гематоэнцефалический барьер, это разновидность гистогематического (тканево-кровяного) барьера, т.е. образования, которое защищает мозг от попадания в него нежелательных веществ, в том числе и лекарств. Безусловно, для того, чтобы вещество могло оказывать влияние на центральную нервную систему (ЦНС), нужно либо вводить вещество непосредственно внутрь органов этой системы, либо это вещество должно уметь проникать через гематоэнцефалический барьер, если оно принимается в виде таблеток или инъекций.
   Основную функцию по предотвращению попадания нежелательных веществ в мозг играют клетки, которыми образованы кровяные капилляры, т.е. клетки мельчайших сосудов, которые питают мозг кровью. В отличие от остальных капилляров, в мозгу между этими клетками нет промежутков, поэтому транспорт веществ через промежутки между соседними эндотелиоцитами (т.е. клетками капилляров) невозможен.

Компоненты гематоэнцефалического барьера. Обратите внимание на отсутствие "зазоров" между клетками мозговых капилляров (справа). Источник: кликнуть с изменениями.

   Тем не менее, какие-то вещества в мозг всё-таки проникают. И с точки зрения механизмов такого транспорта ГЭБ не является чем-то экзотическим. Вещество может проникать сквозь эндотелий мозговых капилляров как путём пассивной диффузии, так и активно, т.е. с помощью специальных транспортных систем, которые "захватывают" вещество из крови, переносят его через клетку и высвобождают уже в мозгу.
   Прежде чем приступить непосредственно к описанию экспериментов, ещё одно важное лирическое отступление.
   До недавнего времени для сравнения того, насколько различные вещества хорошо проникают в мозг, использовали величину, обозначаемую как lgBB= Cbr/Cpl, где Cbr - равновесная концентрация исследуемого вещества в мозгу, а Cpl - равновесная концентрация в плазме. По оценкам разных авторов веществ относится к CNS+ (т.е. хорошо проникающим в центральную нервную систему), если lgBB больше -1.
   Ну а теперь к экспериментам.
   Первый эксперимент сокращённо называется PAMPA-BBB, что расшифровывается с английского как parallel artificial membrane permeability assay for the blood-brain barrier. Примерный перевод на русский: определение проницаемости ГЭБ с помощью параллельных искусственных мембран.
   Схема эксперимента достаточно проста и позволяет оценить вклад пассивной диффузии в проникновение веществ через мозг.
   Специальная твердая подложка, импрегнируется, как говорят химики, а если по-простому, то пропитывается, липидами, извлечёнными из мозга. Эта подложка является "дном стакана", который вставляется во второй "стакан".

Схема опыта PAMPA. Источник: кликнуть с изменениями.

   В стакан, чьё дно представляет собой подложку, наливается раствор, содержащий исследуемое вещество, после чего начинают исследовать, как изменяется концентрация вещества в двух "стаканах". Если вещество проникает через искусственную мембрану, то в верхнем стакане его концентрация будет падать, а в нижнем - расти.
   По сути, импрегнированная мозговыми липидами подложка моделирует мембрану эндотелиоцита мозгового капилляра. И чем быстрее вещество проникает из первого "стакана" во второй, тем лучше оно будет проникать сквозь ГЭБ.
   Полагают, что подавляющее большинство лекарств проникает в мозг именно по механизму пассивной диффузии, однако есть и исключения, когда весомый вклад вносит активный транспорт. Таким исключением является, к примеру, леводопа - лекарство, которое используется для лечения болезни Паркинсона. Если помните, похожий пример я рассматривал, когда сравнивал ампициллин и амоксициллин. Только там шла речь об активном транспорте антибиотика в клетки желудочно-кишнчного тракта.

Леводопа.

   Леводопа - это аминокислота. Белки-переносчики принимают её за вещество, которое необходимо тканям мозга для синтеза белков, и танспортируют по назначению. Но в мозгу леводопа под действием декарбоксилаз распадается с образованием дофамина, концентрация которого в мозгу больных болезнью Паркинсона понижена из-за гибели нейронов, которые его синтезируют.
   Для изучения активного транспорта применяется эксперимент, который отличается от PAMPA-BBB тем, какую субстанцию "сажают" на подложку.
   За активный транспорт веществ через оболочку клеток во многих случаях отвечают так называемые P-гликопротеины. За счёт энергии, высвобождающейся при гидролизе АТФ, они переносят вещества внутрь клетки.

Структура одного из Р-гликопротеинов. Источник: кликнуть.

   В опытах по изучению активного транспорта на подложке, которая является дном верхнего "стакана", закрепляют слой клеток линии caco-2 (аденокарциномы), в мембрану которых встроены Р-гликопротеины. Далее, как и в верхнем опыте, измеряют изменение концентрацию исследуемого вещества в обоих "стаканах". Фишка состоит в том, что в данном случае опыт повторяют дважды, причём во второй раз вещество помещают в нижний "стакан" и сравнивают скорости переноса вещества в направлениях нижний "стакан" -> верхний "стакан" и нижний "стакан" -> верхний "стакан". Их отношение даёт понять, задействованы ли в переносе Р-гликопротеины.

Схема опыта по изучению проницаемости на клеточной линии caco-2. Источник: кликнуть с измененями.

   С помощью вот таких вот 2 нехитрых опытов, которые без учёта налогов и комиссий стоят 11 000 $ (с комиссиями и налогами - 14 000 $) мы с вами сможем смоделировать транспорт 5 веществ (пирацетама, фенотропила и экспериментальных веществ 1, 2, 3) через гематоэнцефалический барьер. И сделаем это первыми в мире! ;-).